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ELISA試劑盒記錄關(guān)于實(shí)驗(yàn)二抗標(biāo)記
更新時(shí)間:2017-10-06   點(diǎn)擊次數(shù):2118次

ELISA試劑盒記錄:
免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上,通過(guò)這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來(lái)顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。常用的標(biāo)記物包括熒光素、酶和放射性核素等,用這3種標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記的免疫檢測(cè)技術(shù)被稱為3大免疫標(biāo)記技術(shù)。目前,使用的免疫標(biāo)記物還有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。辣根過(guò)氧化物酶 (horse radish peroxidase,簡(jiǎn)稱HRP,EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過(guò)氧化物酶,早在20世紀(jì)30年代就有人著手從辣根中分離此酶,以后又制備出結(jié)晶。本實(shí)驗(yàn)是以辣根為原料,經(jīng)過(guò)水的抽提,硫酸銨和丙酮分級(jí)分離,再經(jīng)鋅離子純化,透析除鹽,冰凍干燥,便可得到高純度的辣根過(guò)氧化物酶。

 

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HRP的制備

1)水提?。悍Q取5kg用水沖刷干凈的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP),用菜刀切成小碎塊,在絞肉機(jī)中絞碎1~2次。碎渣漿用1倍體積的水低溫下攪拌提取過(guò)夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干機(jī)(或離心機(jī))甩干,收集濾液,碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次,合并2次濾液,測(cè)得總體積。. K0 p3 I5 F1 U" R: J
2)硫酸銨分級(jí)分離:在不斷攪拌下,每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當(dāng)于0.40飽和度,0℃),大約在1~2h內(nèi)加完,置冷室中放置過(guò)夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出,下面混濁液以3 000r/min離心15min,棄沉淀,合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌,當(dāng)硫酸銨全部溶解后,置冷室過(guò)夜。次日,虹吸出上清液,沉淀部分在冰凍離心機(jī)中以13000r/min離心20min,棄去上清液,收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150mL蒸餾水中(加水量要使沉淀全部溶解為止),分裝于透析袋內(nèi),放在流動(dòng)自來(lái)水中進(jìn)行透析1~2天,直到硫酸銨透析完畢為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進(jìn)行檢查)。然后改換成用蒸餾水透析,中間更換2~3次,用0.1mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無(wú)氯離子為止。將透析液合并,在冰凍離心機(jī)中以4 000r/min離心15min,棄去沉淀,量上清液的體積。 0 c4 N; R: ^/ ~: F! T$ J7 G
3)丙酮分級(jí)分離:將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中,在不斷攪拌下,用細(xì)滴管沿杯壁加入1倍體積預(yù)冷至-15℃的丙酮,放置片刻,在冰凍離心機(jī)中以4000r/min離心15min,棄去沉淀。上清液再加入0.8體積(按原上清液體積)-15℃丙酮,(操作同上),靜置后,在冰凍離心機(jī)中離心收集沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中,透析除去丙酮??傻肦Z值近于1的酶溶液。
 

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工作濃度的選擇

在免疫酶技術(shù)中,首先要確定的變異因素就是酶標(biāo)記物的工作濃度。因?yàn)槊笜?biāo)記物濃度的很小變化,便可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的波動(dòng)。另外,由于濃度過(guò)高,可使非特異性反應(yīng)增加,而濃度過(guò)低又可影響測(cè)定的敏感性。因此,正式試驗(yàn)前必須準(zhǔn)確滴定其工作濃度。
酶標(biāo)記抗體的滴定方法是:將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上,然后將經(jīng)過(guò)一系列稀釋的酶標(biāo)抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應(yīng),以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來(lái)確定酶標(biāo)記抗體的效價(jià),或稱工作濃度。

 

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